Kari B. Green-Church, 1 Igor Butovich, 2 Mark Willcox, 3 Douglas Borchman, 4 , Friedrich Paulsen, 5 Stefano Barabino, 6 and Ben J. Glasgow 7,8

FIGURE 2. Soft contact lens lipid deposits seen on slit lamp examination (photos courtesy of the Brien Holden Vision Institute).

ポリ（ 2- ヒドロキシエチルメタクリル酸）、ポリ（メチルメタクリル酸） - ポリ（ビニルアルコール）、またはポリ（ 2- ヒドロキシエチルメタクリル酸） - ポリ（ビニルピロリドン） - ポリ（メタクリル酸）でできているハイドロゲルレンズはすべて、 in vitro で溶液から脂質を吸着し、ポリ（メチルメタクリル酸） - ポリ（ビニルアルコール）でできているレンズは脂質を若干吸着しやすい 105 。 PMMA レンズへの脂肪結合は単純な吸着作用であるのに対し、ポリ（ HEMA ）レンズにコレステロールが吸着するとハイドロゲルレンズの素材を崩壊・濃縮して、水分を追い出す可能性がある 106 。

シリコーン含有ハイドロゲルレンズやグループ IV のレンズはフォスファチジルエタノールアミンよりもコレステロールを多く吸着する（ Table. ４） 107 。

グループ Vb のレンズ（ロトラフィルコン A とロトラフィルコン B ）へのコレステロール、スクアレン、コレステロールエステルまたはワックスエステルの結合レベルは、グループ IV の HEMA 素材ハイドロゲルレンズと差がなかった 108 。

初期の in vivo 研究で、 CL への沈着 物 の中に脂質が存在し、主な脂質種は CE であることが示されている 109 。「 jelly bump 沈着 物 」と呼ばれる特殊な タイプ のレンズ沈着 物 が、長鎖および中間鎖の CE 、トリグリセリド、 WE で構成されていることが示されている 110 。 同じく特殊な タイプ で、 定期交換してないハイドロゲルレンズで見られる沈着 物 である「 white spot 」は、主に脂質でできている 111,112 。脂質による white spot 沈着 物 は脂質層による明瞭な層状構造をしており、この脂質層は CL 表面と沈着 物 の主体構造との間で界面を形成している。この初期の界面層は、コレステロール、コレステロールエステル、不飽和脂質でできていることが示されている 111,112 。留意すべきこととして、食事内容がこれら white spot 形成になんらかの役割をしており、アルコール、タンパク質、脂肪の摂取量の多い者はこうしたレンズへの脂質沈着が多い 113 。ハイドロゲル CL の交換頻度が 15 年前に比べてはるかに高くなっている傾向があるため（昔は年ごとだったのに対して、現在は、一般的に 1 週間ごと、 2 週間ごと、月ごとである）、こうした white spot 沈着 物 （ Fig.2 ）は減少しており、現在ではめったに見られなくなっている。

In vivo において、 RGP レンズは多くのソフトレンズ素材よりも脂質が沈着しやすく、これはおそらく、このレンズの疎水性が原因であろう 114 。シリコーンを用いた RGP レンズは、おそらくシリコーンが CL の疎水性を高めるために、フッ素含有の RGP レンズよりも脂質を沈着しやすい。それに対してフッ素は疎水性を低めるので、脂質の沈着が 減る 114 。グループ I （ポリマコンとテトラフィルコン A ）とグループ III （バラフィルコン A ）の脂質沈着の程度は、レンズの素材そのものよりも装用の特性に関係があるようである 115 。 FDA 分類のグループ II のレンズがもっとも脂質沈着し、 FDA 分類グループ III のレンズがもっとも脂質沈着しない 103,114,116 。グループ II のレンズ（ポリビニルピロリドンを含有する）では脂質沈着が時間とともに増加する様子が見られるのに対し（装用 1 日から 28 日、 P < 0.0001 ）、グループ IV のレンズでは脂質沈着は 1 日後に最大に達してそれ以上は増えない 117 。ポリビニルピロリドンを含有するグループ II のレンズでの脂質レベルはグループ IV のレンズのおよそ 2 倍であり 118 、脂質沈着レベルにおいても有意な被験者間変動があった。 Ex vivo でのレンズへの脂質沈着については Table.4 と 5 に示す。

TABLE 4. Deposition of Lipids onto Contact Lenses 107

TABLE 5. Amounts of Lipid Deposited on Lenses during Wear

モノグリセリドが検出されたが、コレステロール、 CE 、トリグリセリドは検出されなかった 122 。しかし装用後のハイドロゲルレンズと RGP レンズからの抽出物にはオレイン酸コレステロール、コレステロール、オレイン酸、オレイン酸メチルエステル、トリオレインが検出されている 114 。こうした結果の食い違いは、調査されたレンズの種類に原因がある可能性があり、極性脂質は非極性脂質に比べて、親水性の高いレンズのほうに沈着しやす い。オレイン酸メチルエステルは、他の種類のレンズに比べて、グループ III とグループ IV のハイドロゲルレンズと RGP レンズに吸着しにくいようである 114 。

シリコーンハイドロゲルレンズ（グループ Vb と Vc ）は、 in vivo での脂質沈着の程度が従来のハイドロゲルレンズよりもかなり高いようである 123 。沈着脂質の中でもっとも多いのがコレステロールだが、オレイン酸やオレイン酸メチルエステルも検出されている 123 。バラフィルコン A 、ロトラフィルコン A 、ガリフィルコン A のレンズ（それぞれグループ Vb 、 Vd 、 Vc ）を用いたもうひとつの研究でも、沈着 物 にコレステロールが検出できたが 123 、オレイン酸やそのメチルエステルはきわめて微量にしか見つからなかった（ Table.6 に概要を記載）。

シリコーンハイドロゲルレンズにおける脂質沈着の総レベルは、ロトラフィルコン A ＜ガリフィルコン A ＜バラフィルコン A の順 であり、 in vitro 実験で得られた序列と量に一致していた 107,108 。これら 2 つの研究におけるコレステロール沈着量の差（レンズあたり 300-600μg ）に関しては説明が難しい 123,124 。さまざまなシリコーンハイドロゲルレンズへのコレステロール沈着を調べた別の研究におけるコレステロールが沈着するレンズの種類の序列は 、 ロトラフィルコン B （グループ Vc ）＜セノフィルコン A （グループ Vd ）＜ガリフィルコン A （グループ Vd ）＜バラフィルコン A （グループ Vb ）であり、この研究ではさまざまな洗浄液や消毒液の使用がコレステロール沈着の有意な 調整 因子であることを明らかにした 120 。 Saville ら 114 は、シリコーンハイドロゲルレンズ（セノフィルコン A またはバラフィルコン A ）装用中の吸着には、 SM と PC ともに広範囲の種類の分子が、 SM C16:0 と PC C34:2 とともに含まれていることを示した。

脂質と CL の臨床変化

浸漬すると、レンズ表面での涙液の乾燥時間が短縮し、レンズ表面の涙液層が薄くなるようであった 125 。

レンズ挿入からおよそ 10 時間で涙液のコレステロールのレベルが明らかに 低下 する 126 。また、ポリマコン（グループ I ）またはエタフィルコン A （グループ IV ）のレンズを装用している患者の涙液のリン脂質濃度は、それぞれ 186 ± 39μg/mL と 162 ± 33μg/mL であり、後者の濃度は CL を装用していない同様の患者で見られる値（ 220 ± 35μg/mL ）よりも有意に低かった（ P = 0.0023 ） 127 。軽微から中等度のドライアイの患者の涙液中のこうしたリン脂質の濃度が、ドライアイではない被験者における濃度よりも有意に低いこと 128 および、よく知られているように CL 装用によって装用者のかなりの割合で眼の乾燥や不快感が引き起こされることから 129,130 、このことは重要な意味を持つ可能性がある。さらに、ハイドロゲルレンズ装用によって極性脂質の濃度が低下および非極性脂質の濃度によって、涙液層中の脂 質の成分構成が変化することが 2 つの研究 131,132 で報告されている。この 2 つの研究では、ソフトレンズ装用中に涙液の極性脂質（リン脂質）のレベル低下に伴って涙液層の不安定化のレベルが高くなることも示されている。涙液中のリ ン脂質が、 CL に沈着した分泌型酵素 IIa 型ホスホリパーゼ A2 （ sPLA2 ）で分解されている可能性がある。エタフィルコン A （グループ IV ）のレンズ に はポリマコン（グループ I ）のレンズに比べて、 IIa 型 sPLA2 が統計的に 有意に多く沈着する 133,134 。涙液層の生化学のこうした変化は、涙液層表面の脂質層の臨床像における明白な変化として現われる 可能性がある 。

もっ とも多く用いられている種類の CL の装用により、涙液層の脂質層の外観が乱されることがよく知られている 135-137 。干渉パターンで評価した脂質層の厚みは、細隙灯下で見られるパターンに基づいて、 6 種類に分類するのが一般的である。これらのパターン（なし、網目様、波様、無定形、色つき、その他）は、なしから色つきの順番に厚みを増していく。レンズ の装用時に RGP レンズまたはソフトハイドロゲルレンズを覆う脂質層の厚みは一様ではない 135-137 。しかし高含水ソフトレンズの表面では継続的に脂質層が増していく 138 。 2 種類の高含水ハイドロゲルレンズであるフィルコン 4A （水分含量 67 ％）とリドフィルコン（水分含量 70 ％）を比較した別の研究によれば、この 2 種類の素材は脂質層の外観については差がなかったが、起床直後のレンズ表面の脂質層は通常の開眼時よりも厚く、起床直後のほうが開眼時よりも涙液層の安定 性に相関していた 139

TABLE 6. Lens Materials and Various Deposit Levels 124

ら 140 は、ソフトハイドロゲルレンズまたはシリコーンハイドロゲルレンズのいずれかの装用で眼からの涙液の蒸発が、非装用時に比較して増えることを示した。レン ズの種類による蒸発速度の差は 統計学的に 有意ではなかったが、個人個人ではレンズの種類ごとで有意差が見られた 140 。その他の研究では、オマフィルコン A レンズで脂質層の厚みが増すことが述べられている 140,141 。こうしたレンズが脂質層の厚みを維持する能力は、レンズのフォスホリルコリンが持つ生体模倣の特性によるものだと考えられる。 In vivo ではガリフィルコン A レンズ（シリコーンハイドロゲル）がアルファフィルコン A （グループ II の HEMA ）よりも脂質層が厚くなり、前者は後者よりも涙液層をより安定させられると考えられる 141 。

無症状のレンズ装用者と有症状のレンズ装用者との間では、レンズを装用していない状態での脂質層の厚 み（脂質層パターン）や涙液層の安定性に差は見られない 142 。しかし、たとえ脂質層の外観に差がなくとも、レンズ装用不耐者の涙液層の安定性は装用耐性者に比べて低下している 143 。また、 CL 装用不耐者（ CL を日中 6 時間以上装用することができないことで判定される）は涙液層中のマロンジアルデヒドと 4- ヒドロキシ -2(E)- ノネナール（多価不飽和脂肪酸と 関連 エステルの分解産物）のレベルが高い。さらに、不耐者は涙液中の sPLA2 が耐性者に比べて有意に多い。閉塞したマイボーム腺の数は両群間で差はなかった 144 。

涙液の脂質－タンパク質相互作用

涙液の脂質－タンパク質相互作用に関して影響力のある論文が 1973 年に発表された 12 。 Holly はムチンによって脂質の拡散が促進されることを示した 12 。高い表面気圧と低い表面張力によって、マイバムの脂質は一塊になって小滴を作り、水の表面に広がっていかない。ムチンを水に溶かすと、いわゆるムチン－ 水ゲル勾配（ Fig.1 ）によって、表面張力が下がり、マイバムの脂質が水層表面に広がることができるようになる。

リポカリン

涙液層中のコレステロール、脂肪酸、脂肪アルコール、糖脂質、リン脂質がリポカリンと結合し、その結合は 複数の段階でのクロマトグラフィーの分離を経ても残る 145 。続く涙 液 リポカリン結合研究によって、アポ涙液リポカリンがリン脂質とステアリン酸に対して、それぞれ 1.2 および 1.3μM という高い親和性（ K i ）を持ち、コレステロールに対しては 15.9μM というはるかに低い親和性（ K i ） を持つことが明らかになった。脂肪酸では、結合親和性が炭化水素鎖の長さに相関している。涙液リポカリンは溶解度が最小の脂質に対してもっとも強力に結合 し、そうした脂質の水溶液中の最大溶解度を飛躍させる。以上のデータから、涙液リポカリンは涙液層中の脂質を溶解・輸送していることが考えられる 145,146 。リポカリンは涙液中の主要なタンパク質であり、涙液サンプル中の全タンパク質の 33 ％を占める 147 。リポカリンは涙腺から分泌され、マイボーム腺分泌物の中にも検出されている 148 。涙液リポカリンの構造、機能、分子的作用機序が最近になってまとめられている 149-151 。

タンパク質の穴に収まる前に、複数の結合部位を 10 -9 秒単位で探索する過程を記述した。 Fig.3 の濃い赤は安定性が高い消光すなわち静止部位を表わしている。その後、涙液リポカリンが人工リガンドである 1,4- ブタンジオールと結合した 4 個のタンパク質分子 によって 空間群 P2 1 で結晶化され、 X 線構造が 0.026 nm （ 2.6 Å ）の解像度で解析された 155 。 Breustedt ら 155 は、 β バレルのループ領域と隣接領域が立体配座的にきわめて柔軟であり、そのおかげで涙液リポカリンが大きさや形が大きく異なるリガンドに適合できることを示し た。このように観察されたリガンド認識において無差別的であることが、涙液リポカリンの機能と涙液層での脂質－タンパク質相互作用を理解する上で重要であ ると考えられる。

Tiffany と Gouveia 156 は、涙液粘性研究の中で脂質とタンパク質の相互作用の意義を見いだした。リポカリンは脂質と結合する際に二量体を形成することを提唱した。しかし、より最 近の 研究 で は 、涙液層中で涙液リポカリンが主に単量体として存在して、二量体形成は微量であるらしいことが示された 153,157 。

涙液リポカリンの欠乏はマイボーム腺機能不全に関係しており 158 、上記の研究によりリポカリンが脂質を隔離させることが示されている。リポカリン／脂質複合体と脂質層とが相互作用するか否かということが最近の研究の焦 点になっている。 Millar ら 159 が in vitro 研究でヒトのマイバムを用いたところ、リポカリンはヒトのマイバム脂質膜に対してリゾチームやラクトフェリンに比較してゆっくり結合した。ヒトのマイバム 脂質膜へのリポカリンの吸着は、ウシのマイバム脂質膜への吸着とは大きく異なっており、このことは涙液層の脂質の性状が吸着過程にとって決定的に重要であ ることを示している。

こうした研究に基づけば、涙液脂質－タンパク質相互作用が in vivo で起きており、そうした相互作用が涙液の物理性状を変化させるようである。理解にはまだいくつかの隙間があるが、それらが埋められた時、ドライアイと MGD の症状を軽減する治療法の開発が可能になるだろう。

FIGURE 3. The solvent-accessible surface of TL. Residues are colored according to the static quenching constants observed with C12SL. Reprinted from Gasymov OK, Abduragimov AR , Glasgow BJ. Intracavitary ligand distribution in tear lipocalin by site-directed tryptophan fluorescence. Biochemistry . 2009;48:7219–7228 with permission from the American Chemical Society.

リゾチーム

涙液に存在する主要なタンパク質のひとつであるリゾチームは、ムコ多糖類を脱重合化する溶菌タンパク質として働く。リゾチームはリポカ インとは異なり脂質を隔離しないが 146 、 in vitro で膜リン脂質とマイバム膜に相互作用・結合する 17,159,161,162 。リゾチームは、脂質層の構造を安定させるだけでなく、疾病時にリゾチームが消失するとこの安定性が乱され、蒸発速度が高まることになる。

涙液リゾチームの濃度が疾病や薬剤で変化すると、涙液層の脂質層の構造が乱される可能性がある。リゾチームと涙液脂質との相互作用につ いて 分光学的 手法を用いて in vitro で明らかに し 、リゾチームの濃度変化による脂質層の構造変化で蒸発速度が上昇するかどうかを決定することが有用だろう。

アポリポタンパク質 D

アポリポタンパク質 D （ apoD: apolipoprotein D ）は、リポカリンスーパーファミリーに属し、涙腺で産生されることが判っており、涙液中に検出される 163 。 apoD の生理機能は現在不明であるが、リン脂質やコレステロールなどの脂質に結合することができる。涙液におけるこのタンパク質の機能は、ヒトの涙液中に存在す るマイボーム腺脂質と相互作用することであり、それら脂質が おそらく 表面に拡散することに寄与している可能性がある。もうひとつ考えられる機能として、有害な親油性分子から角膜を保護する浄化因子である可能性がある 163 。

リン脂質輸送タンパク質

ヒトの涙液中のリン脂質輸送タンパク質（ PLTP: phospholipid transfer protein ）とコレステリルエステル輸送タンパク質（ CETP: cholesteryl ester transfer protein ）が、ウェスタンブロット法で調べられ、 ELISA で定量されている 164 。 PLTP は涙液で存在が見つかったが、 CETP は見つからなかった。 ELISA によれば、涙液の PLTP 濃度は 10.9 ± 2.4μg/mL であり、ヒト血漿での濃度のおよそ 2 倍高い。 PLTP が促進した涙液での脂質輸送活性は、 15.1 ± 1.8μmol/mL/h であり、これも血漿での値より有意に高い。以上の結果から、 PLTP は涙液の脂質輸送に関わることで涙液層の形成に関与していると考えられる。しかし、涙液における PLTP の濃度はリポカリンに比べてかなり低く、特に PLTP が涙液の脂質に結合することは示されていない。

Millar ら 3,162 の研究によれば、 in vitro においてムチンはマイバムに結合するが、ムチン－脂質相互作用はこれまでに分子レベルで研究されたことがない。現時点で、ある種のムチンが脂質層と相互作 用するというエビデンスはなく、その反対に、ムチン－脂質相互作用が存在しないというエビデンスもない 165 。

リポカリンに結合した脂肪酸とコレステロールは量については定量されているが、リポカリンに結合するリン脂質とリゾリン脂質の 量と 種類については調べられていない。また、涙液中のほとんどのリン脂質がリポカリンに結合できるということも考えられる。さまざまな脂質との相互作用につい て精力的に研究がなされているが、ムチン－脂質関係との直接的な関係があるとしても依然として謎である。リポカリン、リゾチーム、涙液成分とマイバム脂質 との結合によってタンパク質や脂質の分子構造に変化が起きるかどうかは、研究がまだ至っていない。加齢や MGD でマイバムの成分構成が変化することでタンパク質とマイバム脂質との結合に変化が起きるかどうかもまだ判っていない。

物理化学的特性と推定される機能についてエビデンスが得られ、研究が進むにつれて、涙液層の改変図にサーファクタントタンパク質が取り 入れられる ようになった。この観点は、小型の疎水性サーファクタントタンパク質 B と C が涙液層の脂質成分の中に埋め込まれていて、自らの両親媒性に従って向きを揃えている可能性を示している。それだけでなく、水溶性で重合可能なコレクチン 様のサーファクタントタンパク質 A と D が、既知である分泌したムチンおよび開裂（ shedding ）したムチンとともに涙液層の水層区画において配列している可能性もある。この仮説モデルは、眼表面の重度の疾患（ドライアイ症候群や細菌・ウイルス感染 症など）に関係する機能をサーファクタントタンパク質が持つ可能性の根拠になっている。 仮に 、小型の疎水性サーファクタントタンパク質 B と C が無ければ、涙液層の安定性が変化し、その結果、涙液層それ自体が破綻して、ドライアイ症候群の徴候（ドライスポットなど）が引き起こされる 可能性がある 。

さらなる研究により、成熟型と前駆型のオープン・リーディング・フレームを含むこれら 4 種のサーファクタントタンパク質の工業生産が、遺伝子組換え法によってできるような発現システムを確立する必要 が ある。この方式で産生した遺伝子組換えサーファクタントタンパク質は眼表面と涙器の機能研究に用いることが可能だろう。遺伝子組換えサーファクタントの中 には、すでに工業生産されているものある 177,178 。現代のソフトウェアプログラムと手法を用いれば、タンパク質の比較モデリング法またはスレッディング法を利用して、信頼性の高いタンパク質の三次元構造 モデルを作り、活性部位を特定することが可能である。想定される活性部位の遮断や修飾によってタンパク質の機能を改変し、機能レベルで全く新しいタンパク 質を作り出すことも可能である。

結論

涙液層の分子構成（プロテオミクス、リピドミクス）と、涙液層へのマイボーム腺の関与を解明することが、涙液層の不安定 化 、ドライアイ症候群、コンタクトレンズ不耐症などの眼疾患を理解する上できわめて重要である。

マイボーム腺分泌物と涙液層の構成成分の解明は、これまで分析手法や生化学手法に限界があったために難しかった。 大半の 分析手法 は 感度が低く、解像度が悪く、サンプルが大量に必要（プールが必要）で、検出にあたっては誘導体化を必要とするものだった。こうした制限のために、長時間に わたるサンプルの曝露によるサンプルの分解の可能性、誘導体化によるサンプル回収率の悪さ、高温分析に曝すことによる異性体化や分解、脂質の具体的な分子 成分構成に関する情報不足、 および 汚染がもたらされていた。近年、分析手法と生化学手法の新たな進歩によって、マイボーム腺分泌物と涙液層成分を調べる手法が改善され、脂質、タンパク質、 翻訳後修飾、タンパク質－脂質相互作用における具体的 な 特定の分子構成成分を同定することが可能になった。涙液層の不安定 化 の他覚所見と自覚症状については比較的よく解ってきているが、涙液層の個々の分子成分と、 MGD および涙液層の安定 性 との関係についての解明は、まだほんの端緒についたばかりである。

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